Elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)常見問(wèn)題分析

　　1、ELISA試劑盒試驗(yàn)出現(xiàn)非常弱的結(jié)果，常見有7種原因，其解決方法如下：

　　1)可能原因：溫育的時(shí)間或者溫度不夠；

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　2)可能原因：顯色反應(yīng)時(shí)間太短；

　　解決方法：校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)。

　　3)可能原因：所用配制緩沖液的蒸餾水有問(wèn)題；

　　解決方法：使用新鮮合格的蒸餾水。

　　4)可能原因：加入/酶的稀釋液濃度太低；

　　解決方法：按照說(shuō)明書保存試劑盒和準(zhǔn)確配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。

　　5)可能原因：酶標(biāo)儀濾光片不正確；

　　解決方法：檢查酶標(biāo)儀使用的濾光片。

　　6)可能原因：試劑盒沒(méi)有充分平衡；

　　解決方法：試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫。

　　7)可能原因：不正確的試劑儲(chǔ)存方式；

　　解決方法：按照說(shuō)明書要求保存試劑盒。

　2、ELisa試劑盒試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差，這是什么原因造成的？

　　答：試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差，這是典型的由測(cè)定操作引起的問(wèn)題，常見原因如下：

　　a)可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；

　　解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。

　　重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與次接近；

　　重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；

　　樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

　　b)可能原因：加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；

　　解決方法：重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過(guò)快。

　　c)可能原因：加錯(cuò)樣本；

　　解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯(cuò)樣本。

　　d)可能原因：加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；

　　解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

　　e)可能原因：不同批號(hào)試劑盒中組分混用；

　　解決方法：不同批號(hào)試劑盒中組分不可混用。

　　f)可能原因：溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；

　　解決方法：檢查時(shí)間是否一致。

　　g)可能原因：孔內(nèi)污染雜物；

　　解決方法：離心樣品，排除雜物。

　　h)可能原因：試劑/樣品沒(méi)有混勻；

　　解決方法：充分混勻樣品和試劑。

　　i)可能原因：血清標(biāo)本未*凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血

　　細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。

　　解決方法：待血清標(biāo)本*凝固后做試驗(yàn)。

　　3、 試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽(yáng)性對(duì)照不顯色，應(yīng)如何分析和查找原因？

　　答：試驗(yàn)結(jié)果白板，而且陽(yáng)性對(duì)照不顯色，常見原因如下：

　　a)可能原因：漏加或者誤加試劑；

　　解決方法：檢查試驗(yàn)記錄和剩余試劑。每次加液前均應(yīng)核對(duì)標(biāo)簽。

　　b)可能原因：試劑過(guò)期；

　　解決方法：使用有效期內(nèi)的產(chǎn)品。

　　c)可能原因：洗板液配制中出現(xiàn)問(wèn)題，如量筒不干凈含HRP酶抑制物（疊氮鈉

　　等）；

　　解決方法：使用干凈的器皿，正確配制試劑。

　　d)可能原因：溫育的時(shí)間或溫度不夠；

　　解決方法：校正溫育箱溫度。

　　e)可能原因：標(biāo)準(zhǔn)品失活或者丟失；

　　解決方法：標(biāo)準(zhǔn)品正確保存、溶解和混勻。

　　f)可能原因：失活或者丟失；

　　解決方法：更換或者提高濃度

　　g)可能原因：酶失活或者丟失

　　檢查方法：把工作濃度的酶再稀釋20－100倍，取5uL加入50ul的顯色底物，終止后顯色是否能達(dá)到1.0左右，此為酶的粗略估計(jì)。

　　解決方法：更換酶或者提高酶的濃度。

　　h)可能原因：顯色底物失活

　　檢查方法：加少量的工作濃度的酶，TMB是否很快顯色。

　　解決辦法：更換顯色底物.

4. Elisa試劑盒試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，這是什么原因造成的？

　　答：試驗(yàn)結(jié)果空白背景高，常見原因如下：

　　a)可能原因：洗板不干凈；

　　解決方法：充分洗滌，*拍干；洗板要防止交叉污染；濃縮洗液準(zhǔn)確配制；吸嘴盡可能一次性使用；加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染。

　　b)可能原因：顯色液變質(zhì)或者試劑過(guò)期；

　　解決方法：檢查試劑盒有效期。

　　c)可能原因：試劑稀釋有誤，如加酶的濃度過(guò)高；

　　解決方法：請(qǐng)按說(shuō)明書所示稀釋倍數(shù)配制；

　　d)可能原因：蒸餾水受酶等污染；

　　解決方法：使用新鮮蒸餾水；

　　e)可能原因：試劑混用；

　　解決方法：不同批號(hào)試劑勿混用。

　　f)可能原因：培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

　　解決方法：顯色反應(yīng)時(shí)間適當(dāng)縮短。